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small RNA 測序
small RNA(包括 miRNAs、siRNAs 和 piRNAs 等)是生命活動重要的調控因子,在基因表達調控、生物個體發育、代謝紊亂及疾病發生和發展等生理過程中發揮重要作用。miRNA 是一類內源性的、長度約 18-25 nt、具有調控功能的非編碼 RNA,通過和靶基因堿基配對引導沉默復合體降解 mRNA 或阻礙其翻譯。Small RNA 測序技術不受物種限制,既能鑒定特定條件下表達的 miRNA,又能預測發現新的 miRNA,對于疾病的發生發展研究有重要意義。
歐易特色
高度靈活性
可研究任一 17-35 nt 之間的小 RNA 分子
高度準確性
可準確到單核苷酸水平,有利于區分高度同源的小 RNA 分子和鑒定小 RNA 的多態性
檢測動力學范圍廣
可在超過 6 個數量級范圍內實現準確的序列檢測和定量分析,有利于低豐度小 RNA 差異表達的研究
數據質量高
深度測序保證了抽樣隨機性、可靠性和重復性,與實時定量 PCR 結果具有較高的一致性
推薦測序模式
●  Hiseq X Ten, PE150    ●  10 M 或 20 M clean reads/樣本
案例展示
案例一  輪狀病毒編碼的病毒樣 small RNA 通過 PI3K/Akt/mTOR 通路靶向 IGF1R 觸發宿主細胞自噬
研究背景
輪狀病毒是雙鏈 RNA 病毒,它是嬰兒病毒性腹瀉的主要原因。病毒可以創造一個微環境,通過編碼 miRNA 等靶向調控各種宿主細胞的分子來促進其生存和自我增殖。然而,RNA 病毒是否編碼 miRNAs 以及其調控機制仍有待于探究。
研究內容
歐易生物攜手中國醫學科學院醫學生物學研究所,發現輪狀病毒(Rotavirus, RV)編碼的 small RNA RV-vsRNA1755 可以通過 PI3K/Akt/mTOR 通路靶向調控 IGF1R 觸發宿主細胞自噬。通過 small RNA 測序分析確定研究對象 RV-vsR-NA1755,發現 RV 感染初期其通過靶向調控 IGF1R 導致 PI3K/Akt/mTOR 通路受到抑制,并觸發了細胞自噬,但最終會抑制自噬體的成熟。

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研究結果
1. small RNA 測序發現,Chr17_1755 在 RNV 感染后表達量顯著性升高,因此 Chr17_1755 可能是 RV 負責編碼的 small RNA。
2. 通過 mirdeep2 預測 Chr17_1755 前體序列并將 PCR 產物與 RV NSP4 基因組比對,確定 RV-vsRNA1755 (Chr17_1755) 來自于 RV,且由 NSP4 編碼。
3. 通過 miRanda 靶基因預測、熒光素酶報告實驗、qRT-PCR 和 WB 等確定 RV-vsRNA1755 調控 PI3K/Akt 通路中 IGF1R 的表達。
4. 對不同感染階段 Akt 和 mTOR 的磷酸化水平進行檢測發現,在 RV 感染初期,PI3K/Akt/mTOR 通路被抑制,檢測細胞自噬水平發現 RV 感染引起細胞自噬。
5. 過表達 RV-vsRNA1755 和沉默 IGF1R 均發現促進了 LC3II 的形成和 P62 的降解,同時細胞自噬水平升高。
參考文獻
Zhou Y, Geng P, Liu Y, et al. Rotavirus-encoded virus-like small RNA triggers autophagy by targeting IGF1R via the PI3K/Akt/mTOR pathway. BBA-Mol Basis Dis 2018; 1864(1): 60-68. (IF: 5.476)
常見問題
1. small RNA 測序后進行 RT-PCR 驗證時,?;岢魷址翹匾煨岳┰?,如何解決?
因為 miRNA 序列比較短,彼此間相似度又非常高,尤其是同一家族的 miRNAs,彼此間可能只有 1 個堿基差異,出現非特異性擴增是很正常的,建議使用 Taqman 探針法進行嘗試。
2. 沒有參考基因組可否進行 small RNA 測序?
進行生物信息分析時,針對有參考基因組樣本,以該物種的基因組以及該物種的 miRBase 數據庫為參照進行數據分析;如果沒有參考基因組,可以近緣物種的基因組以及近緣物種的 miRBase 數據庫為參考,或者動物樣本以所有動物的 miRBase 數據庫、植物樣本以所以植物的 miRBase 數據庫為參照進行比對分析。
3. small RNA 測序對樣本有什么特殊要求?
為防止 small RNA 丟失,浪費樣本、時間和精力,抽提 total RNA 時請使用 miRNA Homogenate Additive。如果同一份樣本同時檢測 mRNA/lncRNA 和 small RNA,請事先告知該區域負責的銷售工程師,請公司抽提人員注意保留 small RNA。


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