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三代全長轉錄組測序
PacBio Sequel的長讀長可實現全長轉錄本測序,并使基因可變剪接形式的識別成為可能,因此可以對新基因及其Iso-form進行多方面研究。同時,長讀長不再需要對RNA-Seq的Reads進行組裝,因此可以更完整的對基因模型和轉錄的基因進行多方面注釋,用以改進參考基因組中的基因注釋信息。
文庫構建流程
PacBio Sequel系統使用的全長轉錄組建庫有SMARTer®和SuperScript®兩種方式。經過對儀器和試劑的調試,歐易使用效率更高的Clontech公司的SMARTer® PCR cDNASynthesis Kit進行建庫。
相比前代RS系列測序儀,Sequel系統在SMRT Cell片段長度偏好性方面已經有很大改進,4 kb以下的建庫無需進行片段大小選擇。

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分析流程

2

Sequel數據分析流程示意圖
數據分析內容
Iso-seq分析包含4個主要的步驟,分別是CCS,Classify,Cluster和Subset(可?。?/span>
CCS步驟
該步驟主要基于來自同一條Polymerase Read中的Subreads序列構建CCS序列
Classify步驟
該步驟通過分析CCS序列,輸出兩個文件
一個文件包含全長非嵌合體序列(Full-length Non-chimeric Reads)和非全長序列
在該過程中,Classify步驟會去除CCS序列中包含的PolyA/T Tails和Primer序列,去除污染序列,但是會保留PCR引起的嵌合體序列
Cluster步驟
該步驟基于全長非嵌合體序列和非全長序列,進行質量校正處理,生成Polished高質量的一致性序列和低質量一致性序列
Subset步驟
這是一個可選步驟,主要用于從輸出文件中將指定類型的序列輸出出來,比如非嵌合體Reads等

根據測序樣本對應參考基因組的有無,會有分析內容上的差異。如果進行三代全長轉錄組測序的同一批樣本有二代轉錄組測序的數據(或同時進行二代轉錄組測序),則可以將二、三代轉錄組測序的數據結合進行分析,增加表達差異信息。
*歐易公司最近對分析流程進行升級,無參全長轉錄組測序也能夠進行可變剪接分析。
案例展示
在真核生物中,大多數基因都可以通過選擇性剪接產生多種轉錄本,大大提高了基因組的蛋白質編碼潛力[1]。來自相同基因的可變剪接產生的不同轉錄本可能具有顯著差異,甚至拮抗作用[2]。短讀長的RNA-seq不能跨越轉錄物的全長,難以整體表征轉錄本異構體的多樣性[3]。Iso-Seq可以直接檢測轉錄本的全長,消除了使用算法對轉錄本進行拼裝的步驟。Iso-Seq方法能夠獲得與目標基因或整個轉錄組中的轉錄本有關的可變剪接的外顯子和轉錄起始位點的準確信息及多聚腺苷酸化位點的信息。
人類相關研究中的RNA測序
因為大多數人類基因都存在可變剪接[1],所以知道哪個Iso-form在樣品中表達是準確研究和分析的關鍵。單個基因可能編碼驚人數量的蛋白質,且在某些情況下具有相反的生物學功能[4]。剪接突變已經與各種疾病表型相關聯,許多人類疾病與可變剪接異構體水平的變化有關(List of Diseases)。從短讀長數據進行轉錄本拼裝缺乏敏感性和特異性,這導致RNA測序數據的解釋復雜化[5]。
Iso-seq在人轉錄組研究中的亮點
直接進行全長轉錄本測序,無需進行轉錄本拼裝
對轉錄多樣性進行廣泛或有針對性的研究,以獲得關于替代轉錄的頻率和類型的關鍵信息
特異性地觀察等位基因的表達
區分細胞、組織和疾病狀態之間的Iso-form表達
特色研究:在良好表征的細胞系中發現新的Iso-form[6]科學家在人類胚胎干細胞系中共發現了2,428種新型異構體,其中216種新型基因表現出差異表達。該研究同時證明三代Iso-seq能夠提高二代RNA-seq數據的定量準確度。

3

鑒定前列腺癌(Castration-Resistant Prostate Cancer,CRPR)中的新型Iso-form
直接進行全長轉錄本測序,無需進行轉錄本拼裝
對轉錄多樣性進行廣泛或有針對性的研究,以獲得關于替代轉錄的頻率和類型的關鍵信息
特異性地觀察等位基因的表達
區分細胞、組織和疾病狀態之間的Iso-form表達

4

上圖為使用長讀序列來鑒定和量化在CRPC中表達的全長雄激素受體(AR)Iso-form
確定了截短的Iso-form AR-V9,其顯示出比AR-靶向治療的主要抗性AR-V7更具預測性的生物標志物



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