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核體系酵母文庫
酵母雙雜交(Yeast two hybrid)技術是利用酵母遺傳學方法分析蛋白質之間的相互作用,已被廣泛應用于蛋白質組學、細胞信號轉導和功能基因組學等領域,已成為分子生物學研究領域的重要實驗手段。經過不斷的完善和發展,不但可以檢測已知蛋白質之間的相互作用,更重要的是還可發現與已知蛋白相互作用的未知蛋白。
歐易生物結合多年的文庫構建經驗,推出兩套酵母雙雜交文庫構建體系:
一是SMART體系,在現有酵母雙雜交文庫構建流程(BD MatchmakerTM library)基礎之上加入獨特步驟,使文庫中高豐度表達基因明顯降低,從而使文庫豐度均一提高篩選陽性率;
二是Gateway體系,采用Gateway位點特異性重組技術(Cloneminer cDNA library construction kit)構建文庫。
應用領域
檢測細胞核內發生互作的蛋白質,基于轉錄因子的轉錄激活域AD與DNA結合域BD分別構建融合基因,通過激活報告基因表達,探測蛋白互作。
部分服務單位:中科院上海植物生理生態研究所、上海交通大學、浙江大學、浙江省農科院、山東省農科院
部分物種:人、小鼠、大鼠、對蝦、水稻、擬南芥、牡丹、稻飛虱、蘋果、油菜、小麥、煙草、銀杏、土豆、西瓜、棉花
- A - SMART體系
歐易特色
均一化可有效降低高豐度基因的含量,從而提高篩選陽性率
同源重組一步完成
酵母文庫可用于雙雜、單雜、三雜
若需轉化酵母,可提供100管酵母甘油菌工作液及1-3管母液
- B - Gateway體系
歐易特色
mRNA反轉錄成cDNA構建文庫,不經過PCR可避免冗余現象,保證文庫質量
采用Gateway技術進行建庫,歐易提供的初級文庫可當做普通cDNA文庫使用
三框型接頭可保證蛋白正確表達
歐易提供的次級文庫質粒既可用于共轉篩庫又可用于mating篩庫
如次級文庫用完,可用初級文庫與AD載體重組以獲得次級文庫
酵母文庫可用于雙雜、單雜、三雜
如客戶轉化酵母,歐易可提供100管酵母甘油菌工作液及1-3管母液
提供內容
實驗報告:詳細實驗流程、各階段電泳圖、工作液細胞密度、文庫庫容量、插入片段長度鑒定圖等
Gateway體系可提供初級、次級文庫質粒及菌液
兩種體系比較

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案例展示
案例一  SMART體系——GS9作為轉錄激活因子控制水稻粒型和外觀品質

研究背景
水稻的粒形是水稻產量和品質的關鍵決定因素之一。一般而言,大粒徑高產但品質差。因此水稻育種的一個重要目標是高產加理想的粒形。目前的研究已經克隆了幾個控制水稻粒形的基因的主效QTL,其中大多數基因控制顆粒大小和產量,但對于外觀品質改善有限,并且對這些基因的調控機制和調控網絡研究并不清晰。因此,篩選決定粒形的其他基因/ QTL,對于進一步揭示谷粒性狀分子決定機制、培育高產質優品種具有重要意義。
研究內容
研究者從秈粳亞種間來源的染色體片代換系中,克隆了一個新的控制稻米粒長基因GS9。利用酵母雙雜交文庫,發現GS9能夠與OsOFP14和OsOFP8相互作用;雙熒光素酶報告進一步表明,OsOFP14反饋抑制GS9的表達;利用近等基因系及衍生的聚合系,證明GS9與其他已知粒形基因的表達互不影響,遺傳分析證實GS9調控粒形的效應獨立于GS3和GW5等已知基因。研究顯示,該基因在高產水稻粒形和外觀品質改良的分子育種中,具有很高的應用潛力,這項成果將為解決我國稻米質優高產難題提供重要的理論依據與技術支撐。(本文酵母文庫由歐易生物提供技術服務)

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圖 | OFP與GS9互作并抑制其轉錄激活活性
研究結果
1.水稻染色體片段置換系CSSL N138具有和日本晴相同的粒重,但粒形更為細長。利用F3群體進行圖位克隆,最終將這一基因鎖定在9號染色體,并命名為GS9(Grain Shap Gene on Chromosome 9)。
2.攜帶有GS9基因的日本晴背景的近等基因系NIL-gs9同樣具有更為細長的粒形。在利用CRISPR/Cas9技術敲除GS9的品系中,粒形表現為更細長;而在GS9過表達的品系中,表現為圓形籽粒。
3. NIL-gs9與日本晴小穗穎殼相比,橫向細胞數量減少,但細胞大小增加。推測NIL-gs9粒形變得更為細長,是由于小穗穎殼中縱向細胞長度的增大和橫向細胞數量減少導致的。
4.酵母雙雜交文庫篩選到GS9能夠與OFP8/14相互作用。進一步發現,GSK2能夠與OFP8互作。雙熒光素酶報告實驗證明OFP14/8能夠抑制GS9的轉錄激活活性,并且這種抑制能被GSK2補救。OFP8受油菜素內酯信號通路關鍵因子OsGSK2激酶的磷酸化調控,而OsGSK2不能與GS9和OFP14互作。
5.為進一步研究GS9對基因表達的影響,對NIL-gs9和日本晴進行了轉錄組測序,結果顯示GS9突變會導致一系列基因的變化,尤其是DNA結合和細胞分化相關基因。比較有意思的是,雖然上述研究表明GS9可以和OFP家族蛋白結合,但在RNA層面上,GS9的突變并未引起OFP基因的表達變化。
6.GW5和GS3是兩個已經報道的可以控制水稻粒形的基因,為了研究它們與GS9之間的關系,將攜帶GW5、GS3的
NIL與NIL-gs9雜交,后代表現出更為細長的粒形,表明GS9、GW5、GS3對于粒形的決定具有加性效應;突變gs9對
于其他粒形決定基因沒有影響,表明相互之間沒有直接的關聯。
7.通過多次回交將gs9導入WYJ8和WYJ27品系,或采用CRISPR/Cas9對Y8品系GS9基因進行編輯,子代均表現出更為細長的粒形。
參考文獻
Zhao D S, Li Q F, Zhang C Q, et al. GS9 acts as a transcriptional activator to regulate rice grain shape and appearance quality.Nat Commun 2018; 9(1): 1240. (IF: 12.353).

案例二    Gateway體系——SPX1在大豆磷體內平衡過程中響應低磷脅迫
研究背景
磷是植物生長和新陳代謝所需的一種重要大量元素之一,對體內能量轉化和蛋白質的激活具有重要作用。但截止目前,科學界對植物中磷信號途徑了解很少。研究表明,含有SPX結構域的蛋白質對磷體內平衡和信號轉導具有重要作用。在擬南芥中,SPX家族包含四個基因,水稻中包含6個基因。
研究內容
本文克隆了大豆全長SPX1序列,并對SPX1進行了功能分析。結果表明,SPX1對磷信號通路起到反饋抑制的作用,SPX1通過與MYB48互作參與低磷脅迫應答過程。(本文酵母文庫由歐易生物提供技術服務)

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圖 | GmSPX1與GmMYB48相互作用
研究結果
1.基于擬南芥SPX基因序列進行同源比對,獲取大豆基因組編碼的十個SPX基因。進化分析表明,這十個基因都具有三個外顯子和兩個內含子,具有高度同源性。
2.定量PCR實驗表明,經過低磷處理1天后,GmSPX1, 3, 5, 9, 10在根中表達量顯著提高。而處理5天后,GmSPX1, 2, 4–6在葉片中以及GmSPX2, 4, 6, 8在根中表達顯著上升。另外,處理10天后,GmSPX7–10在葉片中表達上升。所有SPX基因在補充磷元素1天后表達量得到恢復。
3.在擬南芥中過量表達大豆GmSPX1能夠抑制低磷脅迫相關基因(AtPHT1-4, AtPHT1-5, AtACP5, AtRNS和 AtAT4)的表達。同時,在GmSPX1擬南芥同源基因AtSPX3的突變體中,相關基因的表達量上升。GmSPX1表明在磷信號通路起到負調控作用。
4.在野生型和atspx3突變體中過量表達GmSPX1,發現根毛伸長和根毛數量受到抑制。進一步檢測根毛發育相關基因AtUBP14、AtPIP5K-1和AtPIP5K-3的表達量,證實上述基因下調表達。
5.通過酵母雙雜交篩庫實驗,得到與GmSPX1互作的蛋白GmMYB48。并通過BiFC驗證了二者的相互作用。
6.定量PCR實驗表明,GmMYB48在低磷脅迫條件下表達量顯著上升。其擬南芥同源基因AtMYB4在GmSPX1過量表達植株中下調表達。這個結果表明,GmSPX1對AtMYB4的表達起負調控作用。
參考文獻
Zhang J, Zhou X, XuY,et al. Soybean SPX1 is an important component of the response to phosphate deficiency for phosphorus homeostasis.Plant Sci 2016; 248: 82-91. (IF: 3.607)



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