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酵母文庫篩選

在酵母雙雜交系統中,編碼誘餌蛋白和靶蛋白的基因分別克隆進 BD 和 AD 載體,這樣使得待研蛋白可融合表達 GAL4 DNA 結合結構域和 GAL4 激活結構域。以上的兩種載體共轉化酵母細胞。如果誘餌蛋白和靶蛋白能夠相互作用,那么 GAL4 DNA 結合結構域和 GAL4 激活結構域就會相互作用,從而激活 lacZ 報道基因的表達。通過轉化的酵母的表型來確定誘餌蛋白和靶蛋白是否有相互作用。

歐易特色

十余年豐富的文庫構建、文庫篩選經驗         

原裝試劑盒、培養基,保證實驗質量

可提供核體系、膜體系篩庫工作      

可提供共轉、mating 篩庫服務

根據每個客戶的研究目標和內容靈活定制研究方案

常見問題

1. 如何確定是選擇構建核體系文庫還是膜體系文庫?

主要是根據所關注的誘餌蛋白在細胞內的定位情況來確定:
1) 如果誘餌基因是定位在膜上的蛋白則選擇膜體系文庫;
2) 如果誘餌基因是定位于核則選擇核體系文庫;
3) 如果誘餌基因有跨膜區也可以考慮把跨膜區切除后用核體系文庫篩庫,但是這樣操作有一定風險;
4) 如果誘餌基因是定位在細胞質,可以選擇核體系或者膜體系文庫。

2. mating 和共轉兩種篩庫方法到底哪種好?

兩種方法各有千秋,沒有所謂的好與不好,主要根據老師的實驗條件和操作習慣。
只要操作和 BD 構建沒有問題都不會影響篩庫的效率,老師可以選擇任意一種方法進行篩庫。

3. 如果誘餌蛋白有毒性怎么辦?

1) 可以使用低拷貝的 pGBT9 質粒構建誘餌載體;
2) 在某些情況下,在液體培養基中培養不好的菌株可以在固體培養基上生長得很好。
首先重懸克隆于 1 ml 的 SD/–Trp;
接著將重懸液平鋪于 5 個 100 mm 的 SD/–Trp 平板,在 30℃ 下溫浴,直至平板上的克隆相互粘在一起;
5 ml 0.5X YPDA 刮下每塊板上的克隆,并收集到一管中。這樣就可以使用這個該細胞重懸液進行正常的雜交反應。

4. 如果誘餌蛋白有自激活怎么辦?

如果誘餌蛋白有自激活現象,建議找出該蛋白的激活區域,然后將激活區域刪除后重新構建 BD 質粒。
如果自激活不嚴重,可以通過增加篩選的嚴謹度(培養基中添加適當濃度的 3-AT)繼續進行篩選。

5. 其他注意事項 

1)感受態細胞建議在冰上融化。 
2)轉化高濃度的質??上嚶跎儼⒂糜諭堪宓木?。 
3)同時轉化2-3種質粒時可增加質粒的用量。 
4)酵母菌株對高溫敏感,適合生長的溫度為 27-30℃;高于 31℃,生長速度和轉化效率呈指數下降。 
5)菌落變紅不是污染,是酵母細胞生長中一個常見現象:
當細胞在平板培養幾天后,平板上的 Adenine 被酵母消耗完畢,酵母試圖通過自身代謝途徑合成 Adenine 以供利用。

然而,有些菌株的 ADE2 基因被破壞,Adenine 合成途徑受阻;又由于其 ADE4, 5, 6, 7, 8 基因均正常,所以造成中間產物 P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細胞中積累而使菌落變為粉紅色。


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