SEARCH
技術服務021-34781616

中国福彩网375:中国福彩网下载

中国福彩网下载 www.owhxgs.com.cn 熱門搜索關鍵詞:轉錄組基因組甲基化酵母文庫蛋白芯片

021-34781616

當前位置:中国福彩网下载 » 轉錄組 » 原核轉錄組測序
原核生物轉錄組測序
原核生物轉錄組測序是基于 HiSeq 平臺,構建鏈特異性文庫研究原核生物在某個時期或者在某種環境條件下轉錄出來的所有 mRNA。通過轉錄組測序研究可以揭示微生物不同表現型形成的分子調控機制。
歐易特色
具備處理復雜樣本的能力
豐富的原核生物轉錄組測序建庫經驗,有效去除 rRNA
協助客戶快速、準確地進行生物信息分析
可結合客戶的需求,靈活進行定制化信息分析
A. 原核生物轉錄組測序(有參考基因組物種)
推薦測序模式
●  Hiseq X Ten, PE150   ●  1-2 Gb/每個樣本
案例展示
案例一  金黃色葡萄球菌轉錄組測序研究
研究背景
金黃色葡萄球菌可通過參與菌膜形成而引起嚴重感染,然而具體的作用機制并不清楚。
研究內容
本研究中鑒定了AraC-type轉錄調控家族中的一個調節蛋白Rsp。當抑制主要的菌膜相關基因的表達及菌膜形成時,Rsp可促進毒素的產生。歐易生物攜手上海交大仁濟醫院通過轉錄組測序和生物信息學分析研究了Rsp的調控機制。研究表明:Rsp通過上調Agr及下調polysaccharide intercellularadhesin (PIA)來調節毒力影響。深入研究表明,Rsp通過結合 agrP2 和icaADBC啟動子,來促進Agr調控的PSMs 和α-toxin的表達,同時抑制PIA的產生。該研究表明Rsp調控子可作為治療金黃色葡萄球菌急性感染的一個潛在靶標。

1

研究結果
1. 通過對野生菌株191和突變菌株rsp進行轉錄組測序,通過p value < 0.05、FDR < 0.001和FC> 2為標準條件篩選差異表達基因;GO分析富集了20條rsp調控通路;蛋白質間的相互作用通過STRING數據庫獲得;同rsp調控通路有關的114個下調和35個上調基因被關注,相關的調控網絡模型通過cytoscape軟件構建。
2. 通過qRT-PCR驗證差異表達基因,結果表明Rsp抑制了激活細胞進程的基因表達,諸如細胞壁降解和幾條代謝途徑;相反的是Rsp激活了同急性毒性有關的基因的表達,諸如參與到細胞溶解,蛋白降解和調控毒性基因表達的雙組分調節系統。
3. 由軟件RSAT預測agrP2和icaADBC啟動子的結合motif,并通過凝膠遷移實驗檢測Rsp與這些motif的結合情況。實驗結果表明Rsp重組體可以在低濃度(≥ 30 g/ml)就結合DNA片段,而且這種結合是特異的。菌膜因子PIA的表達通過Rsp調控,但不受Agr的調控。
4. 為了確定Rsp對毒性因子產生的影響,分別通過HPLC/MS檢測PSMs,Western blot s檢測α-toxin和protein A,以及immune dot blots檢測PIA的產生。實驗結果表明Rsp調控基因表達水平的變化,進而影響毒性決定因子的含量。α-t oxin和PSMs受Agr調控的結果,同agr/rsp雙突變體的表型是一致的,不能增加溶血細胞。
5. 通過菌血癥和皮膚感染的鼠模型來評估Rsp在毒性的影響。結果表明Rsp明顯地促進金黃色葡萄球菌的急性模式。
參考文獻
Li T, He L, Song Y, et al. AraC-type regulator Rsp adapts Staphylococcus aureus gene expression to acute infection. Infect Immun 2015; 84: 723-734.(IF: 3.731)
B. 原核生物轉錄組測序(無參考基因組物種)
推薦測序模式
●  Hiseq X Ten, PE150   ●  1-2 Gb/每個樣本
案例展示
案例一:黑穗病原菌性別交配和纖維生長的關鍵環境信號研究
研究背景
黑穗病原菌是導致甘蔗黑穗病的主要病源。該菌擁有兩種類型的交配菌株MAT-1 和MAT-2。由于沒有基因組序列或者有效的基因操作方法,黑穗病原菌交配的生理學機制幾乎是未知的。
研究內容
歐易生物攜手華南農業大學研究了黑穗病原菌交配和纖維生長的分子機制。研究通過對突變體SsΔMAT-1b、野生型MAT-1、SsΔMAT-1b X MAT-2和野生型 MAT-1 X MAT-2雜合體進行轉錄組測序,通過比較差異表達基因發現15個上調基因和37個下調基因,這些基因可能受b位點調控,而且GO和KEGG富集分析表明碳代謝途徑和Hog1 MAPK調控的脅迫反應在非交配樣品中是改變的。實驗表明bE/bW雜合二聚體轉錄因子調節葡萄糖代謝和Hog1介導的氧化反應,進而調控黑穗病原菌的性別交配和纖維生長。

2

研究結果
1. 通過對黑穗菌交配和非交配材料進行轉錄組測序,獲得2G的clean sequencing data,所有轉錄本總長為17.8344 Mb,測序深度為100 X。同以前報導的黑穗菌的基因組序列比較,這次的序列總長有些短,可能是由于僅僅poly-A尾巴的序列被錨定和測序。總共獲得7341個unigenes,大部分長度為200–2000 bp, GC含量為50–60%。
2. 通過比較兩組非交配和交配菌株的差異表達基因,結果表明黑穗菌在交配和纖維生長過程中,b位點調控了小分子運輸、囊泡運輸、生物合成、MAPK信號通路調控的逆境脅迫和轉錄網絡的級聯效應。
3. GO富集分析進一步驗證b位點調控代謝、生物合成、跨膜運輸和氧化還原平衡過程,這些過程同交配或者纖維生長緊密相連。KEGG富集分析進一步確認單倍體和交配體均發生信號轉導途徑中的代謝途徑,尤其是淀粉和蔗糖代謝通路。
4. 通過檢測野生型MAT-1、MAT-2、SsΔMAT-1b 突變體、MAT-1 X MAT-2雜合體的生長,以及抗氧化劑谷胱甘肽在單倍體和雜合體菌落及纖維生長的影響,實驗結果表明葡萄糖負向調控黑穗菌交配和纖維生長,且b位點編碼的異源轉錄因子在轉錄水平調控了淀粉/蔗糖代謝。
參考文獻
Yan M, Dai W, Cai E, et al. Transcriptome analysis of Sporisorium scitamineum reveals ciricalenvirommental signals for fungal sexual mating and filamentous growth. BMC Genomics 2016; 17:354. (IF: 3.986)
常見問題及解答
1. 原核生物與真核生物在進行轉錄組測序文庫構建時有什么區別?
在原核生物中,mRNA 只占全部 RNA 的 1-5%,其余絕大部分是核糖體 RNA(rRNA),因此若要測序 mRNA,首先需要先將 mRNA 純化出來。然而,原核生物并不像真核生物 mRNA 具有 polyA 的結構,因此,無法直接利用 oligo(dT) 將
mRNA 純化出來。如果拿 total RNA 進行測序,那么測序的效率會比較差,因為大部分的序列都來自 rRNA。目前,提高原核生物中 mRNA 的量,較為主要的方式是去除 total RNA 中 rRNA。
2. 關于轉錄組 De novo 分析,采用什么軟件進行拼接,使用的參數是什么?
De novo 拼接是指在不依賴參考基因組的情況下,將有 overlap 的 reads 連接成一個更長的序列,經過不斷的延伸,拼接成  transcript。我們使用 Trinity (version:trinityrnaseq_r20131110_ 軟件 paired-end 的拼接方法,對樣本的有效 reads 合并進行 de novo 拼接,取每個 Loci (comp*_c*_) 下較長的轉錄本作為 Unigene,以此作為后續分析的參考序列。參數為
:Trinity.pl --seqTypefq --min_contig_length 200 --JM 400G --left $R1 --right $R2 --SS_lib_type RF --output
trinity_out_dir --CPU 80。
3. Raw data 如何讀???為什么不提供原始圖像數據和中間過程文件?
測序數據文件以 txt 文本格式為主。對于 Windows 用戶,推薦使用 Editplus 或 UltraEdit 作為瀏覽程序,否則會因文件過大造成死機。Unix 或 Linux 系統比較適于瀏覽較大的文本文件。由于 Illumina 更新了 pipeline,測序過程中生成的圖像文件將實時轉化為中間過程文件,這一步完成后圖像文件將被自動刪除,獲取中間過程文件(此文件為二進制文件,只有在 Illumina 機器上才能讀取,通常不保留),在 Illumina 分析軟件下將其轉化為序列文件,即所說的 raw data 。目前各公共數據庫接受 fastq 文件,所以我們提供的 raw data 都是 fastq 文件。


中国福彩网下载

技術熱線:021-34781616 咨詢熱線:4006-4008-26

上海市閔行區新駿環路138號5幢3層
[email protected]
中国福彩网下载
歐易生物微信公眾號
滬ICP備-050455 網站地圖  Copyright ? 2016 上海歐易生物醫學科技有限公司 保留所有權利