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真核轉錄組測序

轉錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能的必然紐帶。真核生物轉錄組測序基于高通量測序可快速地獲得某一物種特定細胞或組織在某一狀態下的所有轉錄本的集合,用于研究基因結構和基因功能、可變剪接和新轉錄本預測等。轉錄組研究已經成為揭示生物生長發育調控、逆境脅迫和抗病反應機制的研究手段。

歐易特色

具備處理復雜樣本的能力

豐富的建庫經驗,加入文庫均一化技術

協助客戶快速、準確性地進行生物信息分析

可結合客戶的需求靈活進行定制化信息分析

A.真核生物轉錄組測序(有參考基因組物種)

推薦測序模式

HiSeq4000, PE150 

6Gb/每個樣本

案例展示

案例一  肝損傷程度決定肝細胞命

研究背景

目前仍缺乏治療肝細胞癌的有效手,已證實細胞衰老在抑制癌病變中起重要作用,因此,作者認為細胞衰老可能成為治療肝細胞癌的潛在靶點。

研究內容

歐易生物攜手第二軍醫大學,探究了肝的損傷程度、肝細胞衰老和癌變三者的關系,其中轉錄組測序實驗和分析工作由歐易生物完成。該文章主要報道了肝細胞衰老可以通過激活免疫監視抑制癌變,肝的損傷程度決定了肝細胞的命運,即走向衰老或者癌變。

真核有參

研究結果

1. 鑒別細胞衰老的三種手段,發現嚴重肝損傷處理后(SALI)細胞衰老程度更高。

2. 比較不同肝損傷程度的小鼠的腫瘤表達水平,發現輕度肝損傷處理(MCLI)的癌變作用更明顯。因此,肝細胞衰老可能具有明顯的抑癌作用。

3. 通過轉錄組測序發現誘導細胞衰老后,Hippo信號通路顯著富集,巨噬細胞相關基因顯著富集。

4. 免疫組化實驗發現肝細胞衰老激活了免疫細胞(如巨噬細胞、CD4 + Th1細胞和NK cells)的表達,表明衰老可能通過激活免疫監視抑制癌變。

參考文獻

Wang C, Chen WJ, Wu YF, et al. The extent of liver injury determines hepatocyte fate toward senescence or cancer. Cell Death Dis 2018; 9(5): 575. (IF: 5.965)

B.真核生物轉錄組測序(無參考基因組物種)

推薦測序模式

HiSeq4000, PE150 

10 Gb/每個樣本

案例展

案例一  白鼬基因組序列草圖研究

研究背景

白鼬是一個重要的用于研究人類呼吸疾病的動物模型。

研究內容

通過家養白鼬的基因草圖組裝,構建了2.28 Gb的基因組序列;對21個白鼬組織的轉錄組測序,注釋了19910個蛋白編碼基因;不同時間點用2個病毒感染42個寄主,并取氣管和肺組織進行轉錄組測序研究了寄主的相關反應;用16個囊性纖維疾病的芯片數據,揭示CFTR敲除白鼬其肺器官早期的轉錄組變化,并可應用于具有囊性纖維疾病的人類嬰兒的研究。

無參1

圖1- 白鼬和人中蛋白序列和組織特異性表達相似

無參2

圖2-受流感病毒感染和CF疾病的白鼬轉錄譜分析

研究結果

1. 對雌性白鼬進行基因組測序,通過ALLPATHS-LG軟件進行基因組組裝,組裝草圖的是2.41 Gb;對不同發育階段和成熟的雄性和雌性組織的24個樣本進行RNA-seq,用Ensembl軟件進行基因組注釋,蛋白基因編碼models通過Uniprot哺乳動物和其它的脊椎動物的蛋白序列進行比對和注釋;通過注釋的蛋白序列構建了系統進化樹,發現白鼬屬于犬科亞目,系統樹分枝的長度表明嚙齒類進化枝的快速進化,也說明相對于人和老鼠來說,人和白鼬具有更少的遺傳多樣性;和基礎細胞生理學相關的GO注釋富集于存在angular sector的基因,其中排行前百分之二十五的白鼬基因同人更接近,這些富集的GO注釋包括核苷酸代謝、細胞核分裂、表達調控和蛋白修飾及定位。總而言之,白鼬和人的蛋白序列的高度相似性,表明許多白鼬蛋白進化上可能是保守的,同人的同源蛋白具有相似的生物學功能。

2.通過比較白鼬和人轉錄豐度的模式研究兩者的基因是否具有相似的組織表達。對14個樣品的相似表達模式的基因進行聚類分析,結果析表明兩者基因的表達模式具有高度一致性和組織特異性;序列比較顯示相對于白鼬其它的基因來說,白鼬大腦、骨骼肌肉/心臟、肺和腎里的轉錄因子和人的同源基因顯示更大程度上的相似性,表明這些基因功能調控的高度保守性。

3.由于人和白鼬呼吸道病毒的受體的相似分布,白鼬經常被用作人流感病毒感染的模型。用兩種全球流感病毒感染白鼬,在不同時間點收集氣管和肺部組織樣品做轉錄組分析,結果表明寄主在氣管組織的轉錄譜變化更加顯著,有9869個差異表達基因,而肺部組織只有4646個差異表達基因。進一步分析說明白,鼬基因組資源可以比較受到人類流感病毒感染后的轉錄組變化,同時揭示這種變化在組織分割區依賴的模式不同。

4.為了研究囊性纖維疾病進程,通過CFTR敲除和正常白鼬的肺組織進行芯片檢測,找到的差異表達基因的功能分析主要為血液凝結系統、免疫缺陷信號、5-羥色胺受體信號和輔助性T細胞信號。人和白鼬囊性纖維中相似的表達變化在更廣泛的生物學功能上也是明顯的,諸如慢性免疫紊亂、吞噬細胞的移動和免疫反應。因此白鼬囊纖維可以作為一個可處理的模型,用于系統性的地研究受傷位點基因表達進程變化,這一點在人中是不可能的。

參考文獻
Peng X, Jessica A, Kevin G ,et al. The draft genome sequence of the ferret (Mustela putorius furo) facilitates study of human respiratory disease. Nature biotechnology. 32(12):1250-5.(IF: 43.113)

常見問題

1. 轉錄組測序是否可以同時檢測mRNA、miRNA及其他非編碼RNA?
理論上技術是可行的,但是通?;岣薟廡蚨韻蟪ざ鵲牟煌?,在測序建庫的時候會選擇不同的片段大小,測序讀長也會有不同。一般來講,如果要進行 microRNA測序的話,通常將microRNA分離出來,單獨進行測序。mRNA測序,通常建庫時選擇200-300 bp大小片段,采用125PE/150PE測序。而長鏈非編碼RNA(lncRNA)存在正向轉錄和反向轉錄,所以常采去除rRNA后進行鏈特異性建庫測序原則。
2. 轉錄組測序需要多少測序量?
由于轉錄組測序需要進行表達量的分析,因此不推薦使用覆蓋度,在確定測序量時,我們以產生的reads數作為依據。轉錄
組測序所需的測序量隨物種轉錄組大小的不同而有所差異。而轉錄組的大小受基因數目和豐度雙重影響,不同物種間變化很大。因此在測序之前,需要對轉錄組的大小進行評估。針對有參考基因組的物種,可通過分析基因組信息,統計編碼基因個數及其堿基數來評估轉錄組的大小,同時也可參考相近或相關物種轉錄組研究的文章;針對無參考基因組的物種,只能參考相近物種的轉錄組大小。
3. Q20、Q30所代表的堿基質量含義?
為了保證數據質量,要在信息分析前對原始數據進行質量評估。每個堿基測序錯誤率是通過測序堿基質量值(Phred score,Qphred)通過公式轉化獲得,而測序質量值是在堿基識別過程通過一種預測堿基判別發生錯誤概率模型計算獲得的,對應關系如下表所顯示: 

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Q20:原始數據中Phred數值大于20的堿基數量占總堿基數量的百分比。

Q30:原始數據中Phred數值大于30的堿基數量占總堿基數量的百分比。

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