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當前位置:中国福彩网下载 » 甲基化研究 » 簡化基因組甲基化測序 (MethylRAD-Seq) » 簡化基因組甲基化測序MethylRAD-Seq
簡化基因組甲基化測序
MethylRAD-Seq
Methyl RAD技術(Wang et al., Open Biol., 2015)使用了甲基化修飾依賴性內切酶,如FspEI、MspJI、LpnPI、AspBHI等,此類內切酶會識別DNA上發生甲基化的胞嘧啶,在識別位置的下游隔一定距離切割雙鏈。若DNA雙鏈具有中心對稱甲基化狀態,則可以切割產生一個固定長度的雙鏈DNA片段。對酶切產生的標簽建庫測序,即可進行甲基化位點的定性和相對定量分析。
歐易特色
文庫構建簡便快速,不經過片段大小選擇,保證了實驗的重復性
具有較強的靈活性,標簽密度可控
標簽長度一致,PCR擴增效率一致,測序深度均一
具有單堿基分辨率,可以做到甲基化位點的定性和相對定量分析
甲基化位點檢測的假陽性率能夠控制在0.50%以內(WGBS假陽性率在0.28%-0.50%)
提供標準和高級生物信息分析,可根據客戶需求提供個性化數據分析
所需的樣本DNA起始量較低
有參無參物種均可,既可用于未知甲基化位點的開發,也可用于不同樣本間的甲基化位點的差異研究
推薦測序模式
● Hiseq X-Ten,PE150    ● 30 M reads/1 G基因組大小
案例展示
案例一  腭融合過程 EMT 機制調控研究
研究背景
腭突上皮細胞發生上皮-間質轉化(EMT)是腭融合的關鍵環節,但是分子水平的調控機制,尤其是胚胎腭發育過程中的增強子甲基化的調控研究,仍不清楚。
研究內容
歐易生物攜手汕頭大學醫學院第二附屬醫院,采用 Methyl RAD 技術對 6 個小鼠胚胎上鄂組織(實驗組為全反式視黃酸處理;對照組為等量的玉米油處理)進行全基因組甲基化研究,通過篩選差異甲基化位點(CCGG 和 CCWGG)、GO 和 KEGG 富集分析,發現腭融合過程調控 EMT 的 3 個基因的增強子甲基化水平發生變化,可作為唇裂治療的新表觀遺傳標記。

methyl-rad

研究結果
1. 6 個小鼠胚胎上顎組織共獲得 800M clean reads,其中 325M reads 具有酶切位點,234M reads 能比對到參考基因組。檢出的差異甲基化位點 CCGG 和 CCWGG 位點分別為 17299 個和 2363 個(p < 0.05, log2FC >1),CCGG 位點平均深度不低于 29X,CCWGG 位點平均深度不低于 8X。
2. 聚類分析結果表明,差異甲基化位點在實驗組的甲基化水平高于對照組的甲基化水平,另外,實驗組和對照組的甲基化模式不同,存在明顯的個體內和個體間甲基化差異。
3. 相比于 DNA 元件中的其他區域,大多數甲基化位點位于內含子和基因間區。
4. 篩選與腭部融合有關、并調控 EMT 的基因,并檢測這些基因增強子的甲基化變化,結果 HDAC4、PDGFR 和 TCF7L2 的差異甲基化位點 CCWGG 位于內含子的非 CpG 島。其中,HDAC4 增強子的差異甲基化位點發生了高甲基化,而 PDGFR 和 TCF7L2 增強子的差異甲基化位點發生了低甲基化,可作為腭融合治療的靶標。
參考文獻
Shu X, Shu S, Cheng H, et al. Genome-Wide DNA Methylation Analysis During Palatal Fusion Reveals the Potential Mechanism of Enhancer Methylation Regulating Epithelial Mesenchyme Transformation. DNA Cell Biol 2018; 37(6): 560-573. (IF: 2.236).
常見問題
1. Methyl RAD 技術中使用的是什么類型的酶?
以其中一種內切酶 FspEI 為例,其識別序列為 5’-CC-3’,且第二個胞嘧啶需發生甲基化,在此胞嘧啶所在鏈的右側第 12 個堿基處、反向鏈右側第 16 個堿基處進行切割,此時若反向鏈中心對稱位置上存在同樣的識別位點,則可切割產生 Methyl RAD標簽,用于建庫測序。

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內切酶 FspEI 的識別及酶切位點
2. Methyl RAD檢測到的甲基化位點數量如何?
Methyl RAD技術文章(Wang et al., Open Biol., 2015)中有Methyl RAD 和WGBS在擬南芥中檢測到的CCGG和CCWGG兩種甲基化位點的數量對比,從中可以看出二者的檢出數量吻合度非常高。

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Methyl RAD、W GBS檢測到的甲基化位點數量對比
(a、b圖中的三行分別對應:基因組上預測出來的、WGBS檢測到的、MethylRAD檢測到的CCGG/CCWGG位點)
3. 如何調整標簽密度?
Methyl RAD技術既可以增加標簽密度,也可以降低標簽密度。增大密度:可同時使用兩種或兩種以上的內切酶進行建庫測序;降低密度:酶切后產生的片段為粘性末端,并且粘性末端的堿基是隨機的。因此,在對酶切片段連接接頭的過程中,可通過選擇性接頭特異地選擇部分標簽進行建庫,以達到降低密度的目的。
參考文獻
Wang S, Lv J, Zhang L, et al. MethylRAD: a simple and scalable method for genome-wide DNA methylation profiling using methylat ion-dependent restriction enzymes. Open Biol. 5, (2015). (IF: 4.822)


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